細菌の細胞表層にはべん毛と呼ばれる細長いらせん繊維状の運動器官があり、細菌の動きを推進しています。そのべん毛は次のようにして先端で成長します。すなわち、その構成たんぱく質がべん毛基部体にあるたんぱく質輸送装置注１）により、その輸送ゲートを通過し、べん毛先端まで貫通するチャネルへ選択的に送り込まれることで成長するのです。これまで、べん毛たんぱく質輸送装置を構成するたんぱく質で、ATP加水分解酵素(ATPase)注２）でもあるFliI（図２）が、べん毛たんぱく質の輸送を駆動するエンジンであるというのが定説でした。しかし、ATP加水分解反応で生じるエネルギーがどのようにべん毛たんぱく質の輸送に使われるかは、長い間の謎でした。
本研究グループは今回、
FliIのみが欠失した変異株ではべん毛が形成されないのに、FliIと同じく輸送装置を構成し、FliIのATPase活性を制御するFliH（図２）をFliIと一緒に欠失させると、わずかにべん毛が形成されること、
輸送ゲートを構成するたんぱく質FlhAおよびFlhBの変異により、べん毛の形成頻度が高くなること、
プロトン駆動力注３）が消失すると輸送が起こらず、べん毛が形成されないこと――を見いだしました。これらにより、FliH（図２）とFliIは、輸送されるたんぱく質が輸送ゲートへ挿入する最初の過程だけを助けていて、その後、たくさんのエネルギーを必要とする輸送過程は、輸送ゲート自体がプロトン駆動力のエネルギーを使って推進していることを突き止めました。これは、ATP加水分解反応がエネルギー源と考えられていた定説を覆すものです。今後は、輸送装置の立体構造を明らかにするとともに、べん毛たんぱく質の輸送におけるたんぱく質分子の動きを詳細に計測することで、その高効率な物質輸送やエネルギー変換の仕組みの解明を目指します。その仕組みは現在の工学技術が生み出す人工機械よりケタ違いに低消費エネルギーの情報処理システムやアクチュエーターなどの設計基盤となり得ます。また、病原性細菌による感染症の予防を含めた新しい治療法の開発にも貢献できるものと期待されます。
本研究成果は、２００８年１月２４日（英国時間）発行の英国科学雑誌「Nature」に掲載されます。
| 戦略的創造研究推進事業 ＩＣＯＲＰ型研究 | ||
| 研究プロジェクト | ： | 「超分子ナノマシンプロジェクト」 |
| 研究総括 | ： | 難波 啓一（大阪大学大学院生命機能研究科 教授） |
| 研究期間 | ： | 平成１４年１２月～平成２０年３月 |
＜研究の背景＞
細菌の細胞表層にはべん毛と呼ばれる細長いらせん型繊維状の運動器官があります。約３０種類のたんぱく質で構成された超分子注４）ナノマシンで、極微小の回転モーターとスクリュープロペラのような構造をしています。細胞膜を貫通する基部体、細胞外に伸びるフック、そしてべん毛繊維――の３つの部分構造で構成されていて、 基部体は直径４０nm長さ５０nmの回転モーターで、べん毛を動かすエンジンとして働き、 べん毛繊維は直径２３nm長さ十数ミクロンのらせん状の繊維で、プロペラのように回転して細菌の動きを推進し、 フックは直径１８nm長さ５５nmのユニバーサルジョイントとして、基体部とべん毛繊維をつないでモーターの回転をプロペラに伝えます。べん毛が構築され細胞外に長く伸びる際には、べん毛を構成するたんぱく質が次々にべん毛先端のキャップ直下へ運ばれて結合します（図１）。
べん毛基部体が細胞内に露出する部分の中心部には、独自のべん毛たんぱく質輸送装置があります（図１）。べん毛たんぱく質は、この輸送装置によって基部体中央基底部にある輸送ゲートを通過し、べん毛の中心軸に沿ってべん毛先端まで貫通する直径２nmの細長いチャネルの中へ選択的に送り込まれます（図２）。その際、このべん毛たんぱく質輸送装置は細胞外のべん毛構築状況をモニターし、フック基部体の構築完了前後で配送するたんぱく質を切り替えることで、べん毛の自己構築過程に必要なエネルギーと物質資源の無駄を減らし、べん毛形成を効率的に進めます。
FliIはこのべん毛たんぱく質輸送装置を構成するたんぱく質の１つで、生体内のさまざまな化学・力学反応機構にとってのエネルギー供給源である、ATP加水分解酵素（ATPase）の１つでもあります。FliI遺伝子が欠失した変異株の細菌ではべん毛が形成されないため、十数年前のFliI ATPaseの発見以来、FliIがべん毛たんぱく質の輸送を駆動するエンジンであるというのが定説でした。この定説は、約１年前に本研究グループが解明したFliIの分子構造が、ミトコンドリアや細菌のATP合成酵素で回転モーターでもあるF1-ATPase注５）とそっくりだったことからも、それが裏打ちされたものと考えていました。しかし、ATP加水分解反応で生じるエネルギーがどのようにべん毛たんぱく質の輸送に使われるのか、という長い間の謎は残ったままでした。
＜研究内容と成果＞
本研究グループは今回、 FliIのみが欠失した変異株ではべん毛たんぱく質が輸送されず、べん毛が形成されないのに、FliIと同じく輸送装置を構成し、FliIのATPase活性を制御するFliHをFliIと一緒に欠失させると、わずかにべん毛が形成されること、 輸送ゲートを構成する膜貫通型たんぱく質注６）のFlhAおよびFlhB（図２）の変異により、べん毛の形成頻度が高くなること、 carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone注７）を用いて細胞膜を横切るプロトン駆動力を消失させると、輸送が起こらずべん毛が形成されないこと――を見い出しました。これらの結果から、FliHとFliIは、輸送されるたんぱく質のＮ末端注８）を輸送ゲートへ挿入する過程（細い糸の先端を小さな針穴に通すという難しいステップ）だけを助けており、その後、輸送されるたんぱく質をほぐしながらチャネル内に送り込む過程（たんぱく質立体構造形成のために折り畳まったポリペプチド鎖をほどいて細いチャネルに送り込むという、たくさんのエネルギーを必要とする輸送過程）は、輸送ゲート自体がプロトン駆動力のエネルギーを使って推進していることが明らかになりました。
べん毛たんぱく質の輸送の仕組みをまとめると図３のようになります。最初、輸送ゲートは閉じています（図３Ａ）。輸送されるべん毛たんぱく質（図３Ａ）で輸送基質と書かれた黒い塊）は、細胞内で合成された後にいったん折り畳まって立体構造を形成していますが、Ｎ末端とＣ末端注８）の数十アミノ酸残基はほどけていて（図３Ａ）でＮおよびＣと表示したひも状の部分）、そのＮ末端をFliHとFliIが捉えます（図３Ａ）。細胞内にはべん毛たんぱく質を結合していないFliHとFliIもたくさんあるので、それらも一緒に集まって、FliIは６分子でリング状の構造を形成し、FliHの助けで輸送ゲートに結合して輸送ゲートを開けます（図３Ｂ）。その際、FliIのリングの真ん中にはべん毛たんぱく質のほどけたＮ末端が結合しているので、それが開いた輸送ゲートに挿入されます（図３Ｂ）。その後、FliIのATP加水分解反応によってFliIのリング構造が不安定になり、FliHとFliIが輸送ゲートからはずれ、輸送ゲートがプロトン駆動力を使ってべん毛たんぱく質の立体構造を解きほぐしながら、べん毛の中心軸チャネル内へ継続的に送り込みます（図３Ｃ）。
本研究は、FliIのATP加水分解反応がべん毛たんぱく質輸送にとって必須であるという定説を覆すとともに、生体内での他のたんぱく質やイオンの膜透過輸送反応において、現在一般的に支持されているATP加水分解による駆動の仕組みとは全く異なる動作をするものであることを示しました。ただし、プロトン駆動力がどのように使われるのかはまだ分かっていません。その仕組みについては今後の研究を待たなければなりません。
＜今後の展開＞
べん毛繊維構成たんぱく質であるフラジェリンは１秒間に約２０分子程度運ばれると見積もられていて、これは毎秒10,000アミノ酸残基に相当します。輸送装置はプロトン駆動力を巧みに利用して、このように高速に、しかも高いエネルギー効率でべん毛たんぱく質の輸送を行っています。今後、Ｘ線結晶構造解析や極低温電子顕微鏡像解析によって、輸送装置の立体構造を明らかにするとともに、１分子計測技術を用いてべん毛たんぱく質輸送におけるたんぱく質分子の動きを詳細に計測することで、その高効率な物質輸送の仕組み、そしてエネルギー変換の仕組みの解明を目指します。その基本的な仕組みは、将来のバイオナノデバイスやバイオナノマシン創製と産業応用に向けた基盤情報となり、現在の工学技術が生み出す人工機械よりケタ違いに低消費エネルギーの情報処理システムやアクチュエーターなどの設計基盤として役立つと期待され、地球環境の将来を守る有効な手段になる可能性を秘めています。また、べん毛たんぱく質輸送装置は、赤痢菌やペスト菌、サルモネラ菌、病原性大腸菌Ｏ１５７など、病原性細菌の病原性因子分泌装置と遺伝的にも機能的にも構造的にも高い類似性があり、両者はタイプ３たんぱく質輸送装置注９）と呼ばれています（図４）。そのため、今回の研究で明らかになったべん毛たんぱく質輸送装置の動作の仕組みは、病原性細菌による感染症の予防を含めた、新しい治療法の開発にも貢献できるものと期待されます。
＜参考図＞
図１ べん毛で泳ぐ細菌の模式図と細菌べん毛の模式図
図２. べん毛たんぱく質輸送装置の模式図
図３. ATPaseとプロトン駆動力の役割
図４. べん毛たんぱく質輸送装置と病原性因子分泌装置の構造比較
＜用語解説＞
注１）たんぱく質輸送装置
生体膜を透過させてたんぱく質を細胞外へ送るための装置。
注２）ATP加水分解酵素（ATPase）
ATP（アデノシン三リン酸の略称。生物界でもっとも普遍的に使われる高エネルギー低分子化合物）を加水分解する酵素の一般名称で、生体内のさまざまな化学・力学反応機構のエネルギー供給源として働く。
注３）プロトン駆動力
細胞膜の内外に生じる電位差や水素イオンの濃度勾配によって形成されるポテンシャルで、べん毛モーターの高速回転や、F0F1-ATP合成酵素の回転によるATP合成機構の駆動エネルギーとしても使われる。
注４）超分子
複数の分子が共有結合以外の結合（配位結合、水素結合など）や比較的弱い相互作用により秩序だって集合した複合体。
注５）F1-ATPase
ミトコンドリアに多く存在し、回転モーターとして動作することによりATPの合成および加水分解活性を持つ超分子酵素複合体。
注６）膜貫通型たんぱく質
細胞膜や細胞内小器官膜など、脂質２重層で構成される厚さ６nmほどの膜を貫通する形で働くたんぱく質の一般名称。細胞内と細胞外の間など、膜越しの物質やイオンの輸送、情報の伝達交換をつかさどる。
注７）Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
プロトン（H+イオン）に特異的に反応する脂溶性分子で、細胞膜のプロトン透過性を増加させることにより、細胞膜を横切るプロトン駆動力を消失させる能力を持つ。
注８）Ｎ末端、Ｃ末端
ポリペプチド鎖（アミノ酸が数十個以上つながった鎖状の高分子）の両末端にはアミノ基（NH2）とカルボキシル基（COOH）があり、それぞれＮ末端、Ｃ末端と呼ばれる。
注９）タイプ３たんぱく質輸送装置
病原性細菌が宿主細胞に感染する際、まずこの装置を使って病原性因子たんぱく質を宿主細胞内に注入し、宿主の細胞膜骨格の構造を乱して細菌の侵入を可能にする。
＜論文名＞
"Distinct roles of the FliI ATPase and proton motive force in bacterial flagellar protein export"
（細菌べん毛たんぱく質輸送におけるFliI ATPaseとプロトン駆動力の役割分担）
＜お問い合わせ先＞
難波 啓一（なんば けいいち）
大阪大学 大学院生命機能研究科 教授
〒565-0871 大阪府吹田市山田丘１－３
Tel：06-6879-4625 Fax：06-6879-4652
E-mail： 
愛宕 隆治(あたご たかはる)
科学技術振興機構 戦略的創造事業本部 研究プロジェクト推進部
〒102-0075 東京都千代田区三番町５ 三番町ビル
Tel：03-3512-3528 Fax：03-3222-2068
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