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平成19年11月6日

科学技術振興機構(JST)
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東京大学 医科学研究所
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経口で腸管から吸収可能なM細胞標的型粘膜ワクチンを開発

(予防接種注射に代わる痛くない粘膜感染症の予防法として期待)

 JST(理事長 北澤宏一)と東京大学 医科学研究所(所長 清木元治)は、各種の感染症に対し、消化器や呼吸器の粘膜を介して効果的に吸収される経口型の粘膜ワクチンを開発しました。
 腸や肺などの臓器にみられる粘膜組織は独自の「粘膜免疫システム(注1)」を持っており、そのシステムが粘膜局所での感染防御に重要な役割を果たしています。この粘膜免疫システムは、粘膜組織にあるM細胞(注2)が免疫系の作動に必要な異物抗原を取り込むことにより始動します。しかし、M細胞の腸管上皮層全体に占める割合は非常に少なく、粘膜ワクチンの開発にはワクチン抗原を効率的にM細胞へ運ぶことが必要不可欠とされていました。
 本研究では、このM細胞のみを認識する特異的なモノクローナル抗体(注3)を世界に先駆けて作り、これをM細胞へのワクチン抗原デリバリー分子としてワクチン抗原を結合させることでM細胞標的型粘膜ワクチンの作製に成功し、動物実験で感染防御に十分な免疫応答の誘導が得られることを確認しました。
 粘膜ワクチンは注射型ワクチンと異なり、全身系での免疫応答に加え、粘膜局所での免疫応答も誘導可能です。本研究で開発したM細胞標的型粘膜ワクチンを各種粘膜感染症に対するワクチン開発に応用することにより、インフルエンザやHIV、ボツリヌス菌といった重篤度の高い粘膜感染症に対する効果的な予防手段の確立につながることが期待されます。また、注射器を必要としない簡便性と安全面の観点からも、次世代型ワクチンとして有望と思われます。
 本成果は、JST戦略的創造研究推進事業 チーム型研究(CREST)「免疫難病・感染症等の先進医療技術」研究領域(研究総括:岸本忠三)の研究課題「M細胞の免疫生物学的解明とそれを標的とする粘膜ワクチンの開発」の研究代表者・清野 宏(東京大学 医科学研究所 教授)と野地智法(JST研究員)、幸 義和(東京大学 医科学研究所 助教)らによって得られたもので、2007年11月5日(米国東部時間)発行の米国医学雑誌「Journal of Experimental Medicine」に掲載されます。

<研究の背景>

 粘膜免疫システムはM細胞から取り込まれた外来抗原に対する抗原特異的免疫応答を、全身のみならず消化器や呼吸器の粘膜に局所的にも誘導します。昨今問題となっている新興・再興感染症(注4)の大半が粘膜感染型であり、この粘膜免疫システムを応用した粘膜ワクチンは、これらの感染症の予防法として最適です。
 M細胞は、腸管粘膜のパイエル板(注5)などに散在する抗原取り込み細胞として、1970年代に解剖学者RL. Owenらによって発見されました。一方、研究チームは本研究課題を通して、パイエル板から遠く離れた粘膜の一部にも抗原取り込み能を有するM細胞が存在することを発見し、絨毛(じゅうもう)M細胞と命名しました(PNAS, 101: 6110-6115, 2004)。しかし、パイエル板M細胞や絨毛M細胞の腸管上皮層全体に占める割合は非常に少なく、粘膜ワクチンの効果を最大限に発揮させ、十分な効果を得るためには、ワクチン抗原をM細胞へ効率よく届けるためのデリバリー技術の開発が必要不可欠とされてきました。
 このため研究チームは、パイエル板M細胞および絨毛M細胞を特異的に見分ける手段としてモノクローナル抗体に着目、この作製を試み、本抗体をデリバリー分子として応用したM細胞標的型粘膜ワクチン開発に挑戦しました(図1)。

<研究成果の概要>

 研究チームはまず、粘膜にあるさまざまな細胞からM細胞だけを特異的に見分けることに取り組みました。マウスを使ったモデル実験では従来、M細胞を見分けるために、植物由来の糖鎖結合たんぱく質の一種であるUEA-1(Ulex europaeus agglutinin I) という分子が用いられてきました。しかし、UEA-1は実際には十分な特異性がなく、M細胞以外に「杯細胞(goblet cell):粘膜上皮層に散在し、粘液を分泌している細胞」にも反応してしまうことが指摘されていました。そこで研究チームは、M細胞だけに反応するより特異性の高いマーカー分子の開発を目指しました。
 マウスのパイエル板より単離精製したUEA-1と反応する細胞を取り出し、ラットに免疫することにより、この細胞と反応する約1,000種類のモノクローナル抗体を調製しました。これら全てについて、反応特異性を免疫組織学的解析により精査した結果、「M細胞とだけ」特異的に反応し、杯細胞には全く反応しない1株のモノクローナル抗体(NKM 16-2-4)を見い出しました(図2)。本抗体は、パイエル板M細胞の他に絨毛M細胞とも反応性を有し、さらには上気道での粘膜免疫応答に重要な鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)(注6)に局在するM細胞も見分けることがわかりました。つまり本抗体は、これまで知られている全ての種類のM細胞と特異的に反応する新規マーカー分子であることを示すものです。
 研究チームは次に、NKM 16-2-4がM細胞標的型粘膜ワクチンを作製する際のデリバリー分子として応用可能であることを確認するため、NKM 16-2-4が腸粘膜にあるM細胞に到達し、取り込まれることを立証しました。蛍光分子で標識したNKM 16-2-4を、パイエル板を含む腸管ループ内に投与し、その後の動態を組織学的に追跡評価した結果、NKM 16-2-4は投与10分以内に腸管粘膜上のM細胞の最も表面側に特異的に結合し、30分後にはM細胞内を移行、4時間以内にM細胞の基底膜へ到達することが明らかになりました(図3 A)
 次に各種感染症に対するワクチン抗原として、破傷風毒素やボツリヌス毒素を不活化したトキソイドとNKM 16-2-4を化学結合させたM細胞標的型粘膜ワクチンを作製し、マウスに経口投与することで、NKM 16-2-4のデリバリー分子として応用性評価のためのモデル実験をしました。その結果、NKM 16-2-4を用いたM細胞標的型粘膜ワクチンは、高レベルの抗原特異的免疫応答を全身系および粘膜系に誘導可能であることが明らかとなりました。(図3 B)。本結果は、NKM 16-2-4のM細胞への抗原デリバリー効果を直接的に実証するものです。また、NKM 16-2-4をM細胞標的型粘膜ワクチンのデリバリー分子として用いることで、免疫に必要なワクチン投与量を1/10以下にまで低減可能であることも明らかになりました。
 また研究チームは、腸管などの粘膜組織から感染し、死にも至るボツリヌス菌由来の毒素を用いたボツリヌス感染実験動物モデルを用い、M細胞標的型粘膜ワクチンによって誘導される中和効果を精査しました。その結果、NKM 16-2-4を用いたM細胞標的型ボツリヌストキソイドを予め経口投与することで、致死量の10,000倍の毒素暴露時においても、100%生存可能な防御免疫の誘導が可能であることがわかりました。これらの結果から、本M細胞標的型粘膜ワクチンの粘膜感染症に対する予防ワクチンとしての高い応用性が実証されました(図3 C)。

<今後の展開>

 現在のワクチンの大半は注射によって接種されており、粘膜投与型ワクチンは非常に馴染みが薄いものです。これは、粘膜ワクチンが注射型ワクチンと比較して免疫担当細胞への抗原送達性に乏しいことに起因しています。今回、M細胞標的システムを開発したことで粘膜ワクチンの効果的な免疫誘導が可能となりました。今後、ヒトを対象とした各種粘膜感染症に対する予防ワクチンを、病原微生物の侵入門戸である粘膜での予防免疫を可能とする「粘膜ワクチン」として開発していくためには、ヒトM細胞標的システムの開発が非常に重要であると思われます。

<参考図>

図1. M細胞標的型粘膜ワクチンの概略
図1. M細胞標的型粘膜ワクチンの概略

図1. M細胞標的型粘膜ワクチンの概略


図2. M細胞特異的抗体(NKM 16-2-4)を用いた免疫組織学的解析(A.免疫組織学的解析)
図2. M細胞特異的抗体(NKM 16-2-4)を用いた免疫組織学的解析(B.免疫電子顕微鏡解析) 図2. M細胞特異的抗体(NKM 16-2-4)を用いた免疫組織学的解析(C.ホールマウント染色)

図2. M細胞特異的抗体(NKM 16-2-4)を用いた免疫組織学的解析

NKM 16-2-4は、UEA-1反応陽性のパイエル板M細胞、絨毛M細胞に特異的に反応し、UEA-1陽性杯細胞や上皮細胞には反応しません。
A) 免疫組織学的解析では、左よりDAPI色素による視野内の全細胞核(青)、NKM 16-2-4モノクローナル抗体陽性細胞(緑)、UEA-1陽性細胞(赤)、およびこれら3つの図の合成図(Merge)を示す。なお、下段は上段の図の一部を拡大したもの。合成図のパイエル板表面の赤矢印に見られるように、NKM 16-2-4(緑)とUEA-1(赤)の両方と反応した場合は、黄色で検出される。 一方、パイエル板表面以外で、UEA-1とのみ反応するものについては赤色のまま残る。
B) 免疫電子顕微鏡解析により、NKM 16-2-4は、UEA-1反応陽性のパイエル板M細胞、絨毛M細胞に特異的に反応することが確かめられた。
C) ホールマウント染色においても、NKM 16-2-4は絨毛M細胞およびパイエル板M細胞と特異的に反応することが確認された。

図3. NKM 16-2-4をデリバリー分子として応用したM細胞標的型粘膜ワクチン(A.腸管ループ実験)
図3. NKM 16-2-4をデリバリー分子として応用したM細胞標的型粘膜ワクチン(B.免疫誘導実験)
図3. NKM 16-2-4をデリバリー分子として応用したM細胞標的型粘膜ワクチン(C.ボツリヌストキソイド投与試験)

図3. NKM 16-2-4をデリバリー分子として応用したM細胞標的型粘膜ワクチン

NKM 16-2-4を用いてワクチン抗原をM細胞へ標的投与することで、効果的な抗原特異的免疫応答が全身系のみならず粘膜系に誘導され、その中和効果も実証されました。
A) 腸管ループ実験の結果を示す。蛍光色素の一種、FITCを結合させたNKM 16-2-4および正常なラットから抽出した非特異的な抗体(IgG)をパイエル板組織(青く染まったのはパイエル板の細胞核)に添加した。この結果、10分でNKM 16-2-4のパイエル板組織表面への集積が認められ、経時的にM細胞内を移行し、4時間後にはM細胞の基底膜へ到達するのが観察された。
B) デリバリー分子としてのNKM 16-2-4の効率評価。NKM 16-2-4に抗原として破傷風トキソイド(TT)やボツリヌストキソイド(BT)を結合し、モデル動物に投与し免疫誘導実験を行った。免疫後に血清中および糞便中の抗体値を調べた。いずれの場合にも、NKM 16-2-4をデリバリー分子として用いた場合、有意に高い抗体産生が観察された。なお、デリバリー分子として正常なラットから抽出した非特異的な抗体(IgG)およびUEA-1(UEA-1)を用いて免疫した場合と、抗原のみ(None)を免疫した場合との比較を行い、効果を評価している。
C) NKM 16-2-4をデリバリー分子として用いたM細胞標的型ボツリヌストキソイド投与後のボツリヌス毒素暴露試験での中和効果の測定。NKM 16-2-4を用いたM細胞標的型ボツリヌストキソイドを予め経口投与することで、致死量の10,000倍の毒素暴露時においても、100%生存可能である防御免疫の誘導が可能であることがわかった。

<用語解説>

注1) 粘膜免疫システム
消化器、呼吸器、生殖器といった臓器にある粘膜組織独自の免疫システム。粘膜局所での感染免疫に重要な役割を果たしています。

注2) M細胞
粘膜上皮に存在する外来微生物や水溶性抗原などの取り込み能力をもった細胞。粘膜免疫システムによって誘導される抗原特異的免疫応答は、このM細胞を介して生体内に取り込まれた外来抗原に対して誘導されます。

注3) モノクローナル抗体
単一の抗原決定基のみを認識する抗体。抗原で免疫したマウス・ラットなどの脾臓、またはリンパ節より単離した抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合することで作製したハイブリドーマと呼ばれる不死化細胞を、クローン化することで調製されています。

注4) 新興・再興感染症
エイズやエボラ出血熱など新しく出現するようになった感染症(新興感染症)、および結核やマラリアなどの一時期減少していたが再び注目されるようになった感染症(再興感染症)。

注5) パイエル板
腸管粘膜に分布する組織で、経口的に腸管腔へと流入する雑多な食餌由来抗原、トキシン、アレルギー起因物質、病原微生物などに対する免疫防御の始動に必須のリンパ組織です。

注6) 鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)
呼吸器に存在する2次リンパ組織。ヒトではアデノイド・扁桃がその一例と考えられています。

<論文名>

A novel M-cell-specific carbohydrate-targeted mucosal vaccine effectively induces antigen-specific immune responses
(M細胞特異的糖鎖構造を標的とした粘膜ワクチンは効果的に抗原特異的免疫応答を誘導する)
doi: 10.1084/jem.20070607

<研究領域等>

このテーマが含まれる研究領域、研究機関は以下のとおりです。

戦略的創造研究推進事業 チーム型研究(CREST)
研究領域 :「免疫難病・感染症等の先進医療技術」
 (研究総括:岸本忠三 大阪大学大学院 生命機能研究科 教授)
研究課題名 :「M細胞の免疫生物学的解明とそれを標的とする粘膜ワクチンの開発」
研究代表者 :清野 宏 東京大学 医科学研究所 教授
研究期間 :平成14年度〜平成19年度

<お問い合わせ先>

清野 宏 (きよの ひろし)
 東京大学 医科学研究所 炎症免疫学分野
 〒108-8639 東京都港区白金台4-6-1
 Tel:03-5449-5270, Fax:03-5449-5411
 E-mail:

瀬谷 元秀 (せや もとひで)
 独立行政法人 科学技術振興機構 戦略的創造事業本部
 研究推進部 研究第一課
 〒102-0075 東京都千代田区三番町5番地三番町ビル
 Tel:03-3512-3524, Fax:03-3222-2064
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