研究課題別研究評価

研究課題名：

やわらかい脳のための堅い分子的基盤～チャネル分子の動態を可視化する～

研究者名：

岡村康司

研究の狙い：

　脳の機能は、ニューロンの細胞膜上のさまざまなチャネル分子を介した電気的な活動に、その基盤をおいている。これらチャネル分子の分布や量の変化が、ニューロンの入出力特性を決定し、学習や記憶などの可塑的変化につながると考えられている。しかし、その仕組みは未だに明らかになっていない。この研究では、可塑的変化の基盤には、発生過程でのチャネル分子の制御機構と共通の部分があると仮定し、ニューロン数が少なく電気的な特性が急速に変化するホヤ胚を用いてチャネル分子を可視化し、これによりニューロンでのチャネル分子の発現が制御される基本原理を明らかにすることを試みた。

研究結果及び自己評価：

　確実にイオンチャネルが変化する過程である脳ができる過程に着目し、発生が速く進むホヤ幼生を用いた。この系は、神経系が極めて少ない数のニューロンで構成され、ニューロンの分化を経時的に追跡できる。ホヤ神経系に発現するイオンチャネルの同定：マボヤ幼生よりcDNA libraryから、種々のイオンチャネルのcDNAを同定した。これらをもとにin situ hybridization 法をおこない、オタマジャクシ幼生のニューロンの位置をほぼ完全に把握した。ホヤ幼生の神経系は、表層に存在する感覚系のニューロンと、尾部神経管内の運動ニューロン、体幹の神経管内の介在ニューロンからなることがわかった。
　Ca²＋チャネルの役割に注目する：イオンチャネルの発生過程での遺伝子発現と、チャネル電流が出現する順序を調べた。神経分化に伴い最初にCa²＋チャネル電流が出現した。また、K＋チャネルの機能を阻害することで、Ca²＋チャネルの機能を間接的に亢進させると、ニューロンの軸索突起の伸長が途中でとまり、軸索の束がばらけるという現象が見られた。神経分化初期に出現するCa²＋チャネルは、その電気的な活動を通して神経突起の伸長に関与していると考えられた。
　Ca²＋チャネルのGFPを用いた可視化：クラゲの蛍光タンパクGreen Fluorescent Protein（GFP）を用いてCa²＋チャネル分子を可視化することができるか検討した。ウサギ心筋Ca²＋チャネルのN末端側及びC末端側にそれぞれ、改変型GFPとの融合させたキメラ分子のcDNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させた。細胞表層にGFPの緑色のシグナルを認め、膜電位固定法により電流計測からGFPを含まないチャネルとほぼ同様な電流特性をもつことがわかり、蛍光信号とチャネル機能の両方持つキメラ分子が発現できた。同様な手法で、マボヤのCa²＋チャネルのN末端側にGFPを融合させた分子を作成し、キメラ分子を作成した（図左）。
　GFP化したCa²＋チャネルのホヤ胚への強制発現：筋特異的プロモーターを用いてGFP化したCaチャネル分子をホヤ胚筋細胞に強制発現させた。ユウレイボヤ胚にエレクトロポレーション法により遺伝子導入すると、幼生尾部の筋細胞において、細胞の輪郭と核のまわりに蛍光信号を認め（図右）、膜系にCa²＋チャネルが分布していると考えられた。細胞膜以外に細胞内の膜系にもチャネルの分布が見られるのは、強制発現により過剰な分子が蓄積されている可能性があるが、チャネルの機能を考慮するとむしろ生理的と考えられる。細胞内の予備的なプールを用意することで、チャネルの分布や量を制御しやすいのではないかと考えられる。現在、キメラ分子をニューロンに発現させる実験を試みている。


図A ツメガエル卵母細胞にGFP-ホヤCAチャネル分子を強制発現した例	図B ユウレイボヤ幼生の尾部筋細胞に細胞の輪郭、各周辺部に蛍光信号が認められる。

　従来、学習などの高次機能や成長にともなう脳の可塑的な変化は、受容体分子などの「性質」の変化に帰せられる場合が多く、チャネルの分布や量の変化に基づいた研究は少なかった。チャネル分子の量や分布の変化と、脳機能との関連を明確にするための方法として、生きた細胞でチャネル分子を可視化することを試みた。
　実験計画はGFPとチャネルの融合分子の作製、チャネル分子を遺伝子発現させる系の確立、発現させたチャネル分子の動態の解析、と3つの部分からなっていた。このうち、最初の二つに関しては、発現させるチャネルをNaチャネルからCaチャネルに変更、また、RNAによる強制発現からDNAベクターをもちいた手法に切り換えるという点で、予定と異なった形で進行したが、実験目的を達成することができた。しかし、画像によるチャネル動態の解析は現在進行中である。その理由は、発現系の完成が遅れたこともあるが、「細胞膜表面でのチャネルと細胞内にストアされているチャネル」を明確に区別する手法を見いだせなかった点にある。pHに反応するGFPの変異体を用いた手法や、抗体と組み合わせた方法を試みることで、手法の洗練化を目指したい。更に、生きた細胞でのチャネル分子の動態を知ることで、今後、脳が外界のさまざまな状況に応じてやわらかく対応できる「知」の分子的「構成」を理解することに貢献したい。

主な論文等：

1.	Nakajo K. Chen L ＆ Okamura Y.(1999)：Cross-coupling between voltage-dependent Ca²＋ Channels and ryanodine receptors in ascidian developing ascidian muscule blastometers ,Journal of Physiology 515:695-710
2.	Okada T., Hirano H., Takahashi K.,Okamura Y(1997): Distinct neuronal lineages of the ascidian embryo revealed by expression of a sodium channel gene. Developmental Biology 190:6197-6201
3.	Okamura Y(1999).,Functional identification of a protochordate L-type Ca²＋ channel, Biophysical Society 1999

This page updated on September 1, 1999

www-pr@jst.go.jp