浅野酵素活性分子プロジェクト

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研究総括 浅野 泰久

研究総括 浅野 泰久
(富山県立大学 工学部生物工学科、生物工学研究センター 教授)
研究期間 2011年10月~2017年3月
特別重点期間 2017年4月~2018年3月
グラント番号:JPMJER1102

 

微生物や動植物由来の酵素を用いる物質生産は、極めて温和な条件下で起こりますが、これらはホワイトバイオテクノロジーと呼ばれ、環境に優しい化学工業技術の1つとして注目されています。

本プロジェクトでは、微生物のみならず植物や動物などにおける高活性な酵素分子が示す反応を探究し、有用物質生産や健康診断法などに資する手法の基盤創出へと展開することを目標としています。有用物質生産の研究においては、微生物・植物・動物から見いだされる新たな酵素を活性分子として活用し、発酵法や酵素的結晶変換法等によるニトリルやアミノ酸などの有用化合物の合成に取り組むことで、これまでの有機合成化学や酵素工学では実現不可能であった技術の基盤を創出し、物質生産プロセスの開発に新たな展開を誘発することを目指します。健康診断法開発の研究においては、アミノ酸代謝に関与する微生物の酵素などを用いて、新しいアミノ酸定量法の基盤技術の創出に取り組むことで、血液中のアミノ酸単体の定量に利用することなどを目指します。このように自然から学ぶことで(新規酵素を探索することで)、環境にやさしい工業技術の確立や新たな診断方法の開発に貢献します。

 

 

研究成果の概要

ERATO浅野酵素活性分子プロジェクトは、微生物のみならず植物や動物などにおける高活性な酵素分子が示す反応を探究し、有用物質生産や健康診断法などに資する手法の基盤創出へと展開することを目標に、2012年に開始しました。

酵素は、生物が産生するタンパク質であり、化学反応を温和な条件で効率的に触媒します。酵素を応用する技術はホワイトバイオテクノロジーと呼ばれ、化学産業において環境にやさしい技術の一つとして注目されています。本プロジェクトでは、酵素の利用分野を拡大するために必要な「実用性の高い新規酵素の発見」および「新規な酵素反応や酵素的手法の開発」に関する基礎的研究を行い、将来のホワイトバイオテクノロジーの発展に貢献することを目標として、研究を実施してきました。

これらの研究を実現するために、異分野の研究員からなる組織作りを行い、組織間の連携による研究の拡大とスピードアップを行うことができました。

 

研究成果

生物資源探索グループ

「目標」生物資源探索グループは、植物や動物の産業用酵素資源としての有用性を検討するため、植物と動物の生物防御に関わるニトリル代謝経路(アルドキシム-ニトリル経路)に着目し、新規ニトリル代謝を探索し、諸性質を解明して、物質生産を実施した。

「結果」植物は微生物から見出されていないニトリル生合成経路を有していた。また動物ではヤスデから見出した酵素群は優れた比活性、熱安定性、pH安定性を有しているだけでなく、既知酵素と相同性が著しく低いことから、ヤスデなどの未開拓の節足動物には新規酵素が多く存在していることが示唆された。植物や動物が次世代の産業用酵素資源になる可能性を実例をもって示した。

  1. Discovery and molecular and biocatalytic properties of hydroxynitrile lyase from an invasive millipede, Chamberlinius hualienensis, Mohammad Dadashipour, Yuko Ishida, Kazunori Yamamoto, Yasuhisa Asano, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 112 (34), 10605-10610 (2015).
  2. Cytochrome P450 CYP71AT96 catalyses the final step of herbivore-induced phenylacetonitrile biosynthesis in the giant knotweed, Fallopia sachalinensis, Takuya Yamaguchi, Koji Noge, Yasuhisa Asano, Plant Molecular Biology 91 (3), 229-239 (2016).

 

生物有機化学グループ

「目標」生物有機化学グループは、タンパク質工学、構造生物学、有機化学分野の連携によって、物質生産への酵素の利用を拡大することを目的に、新規酵素、新規酵素反応、新規物質生産技術の開発を行った。更に、産業応用が期待される酵素についてX線結晶解析を行い、酵素の反応機構を明らかにし、機能改変に結びつけることを目的として研究を行った。さらに構造情報を元にした酵素探索、新規酵素反応の開拓など、従来にない新しい情報の流れを作り出すことを目標として研究を行った。

「結果」生物有機化学グループでは、酵素の立体構造に着目して、新規な反応を触媒する酵素を合目的に開発する方法で、天然に存在しない有用なアミン酸化酵素をD-アミノ酸酸化酵素から創製した。新規酵素反応の探索では、Oxdが新たにエナンチオ選択的ニトリル合成法やKemp脱離反応をできることを見出した。酵素的結晶変換法が水に対する溶解度の低い化合物も適用できることを実証し、酵素的結晶変換を予測するデータベースを作製した。

X線結晶解析から得られた構造情報を、計算化学、バイオインフォマティクスと組み合わせることで、効率的な機能改変だけでなく、新しい酵素のスクリーニングも可能になることを示すことができた。これらの結果は構造情報が酵素工学研究に大きく貢献することを示すものである。

  1. Tailoring D-amino acid oxidase from pig kidney to R-stereoselective amine oxidase and its use in deracemization of α-methylbenzylamine, Kazuyuki Yasukawa, Shogo Nakano, Yasuhisa Asano, Angew. Chem. Int. Ed., 53 (17), 4428-4431 (2014).
  2. Binding of NAD+ and L-threonine induces stepwise structural and flexibility changes in Cupriavidus necator L-threonine dehydrogenase, Shogo Nakano, Seiji Okazaki, Hiroaki Tokiwa, Yasuhisa Asano, J. Biol. Chem., 289 (15), 10445-10454 (2014).
  3. Protein evolution analysis of S-hydroxynitrile lyase by complete sequence design utilizing the INTMSAlign software, Shogo Nakano, Yasuhisa Asano, Sci. Rep., 5, 8193, (2015).

 

酵素工学グループ

分子生物学の発展により、各種期限のタンパク質の異種宿主での発現実験が行われてきたが、多数のタンパク質が封入体として不溶性画分にしか発現しないため、それらの機能を明らかにできない問題点がある。そこで、大腸菌で封入体を形成する酵素を用いて、アミノ酸置換で活性を持つ活性分子としての発現を検討し、新規なタンパク質の可溶化手法を開発することを目的とした。

「結果」二次構造予測法から得られたα-へリックス構造部分のヘリカルホイールを作図し、親水性領域および疎水性領域から、領域の性質と相反するアミノ酸を抽出し、変異導入する「α-へリックス法」、あるいはアミノ酸残基の保存性とその疎水度差が大きい残基を抽出する「Hisol法」を利用することで、可溶性発現に効果的な残基を抽出することが可能であることを明らかにした。また、大腸菌とは異なる酵母を宿主とした場合も利用可能であることを示した。本研究では、大腸菌で可溶性発現できなかった酵素の約50%を、活性分子として発現することに成功した。本成果は、酵素の結晶構造解析や物質変換などへの利用に関する研究の発展に広く利用され、将来、微生物のみならず動植物由来の酵素を産業界で広く利用するために貢献できる。

  1. Heterologous production of L-lysine ε-oxidase by directed evolution using a fusion reporter method, Daisuke Matsui, Yasuhisa Asano, Biosci. Biotechnol. Biochem., 79 (9), 1473-1480 (2015).
  2. New enzymatic methods for the synthesis of primary α-aminonitriles and unnatural α-amino acids by oxidative cyanation of primary amine with D-amino acid oxidase from porcine kidney, Nobuhiro Kawahara, Kazuyuki Yasukawa, Yasuhisa Asano, Green Chem., 19, 418-424 (2017).
  3. Kemp elimination catalyzed by naturally occurring aldoxime dehydratases, Yufeng Miao, Richard Metzner, Yasuhisa Asano, ChemBioChem, 18 (5), 451-454 (2017).