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月田細胞軸プロジェクト

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総括責任者
(現職)
月田承一郎(京都大学大学院医学研究科 教授)
研究実施期間 平成8年10月〜平成13年9月

 

1.研究の概要

 我々の体は、多数の細胞が集まって構成されている。しかし、体中の細胞は、ただ単に細胞が無方向に寄り集まっているのではなく、方向性、すなわち『細胞極性(cell polarity)』を持っている。細胞極性形成の分子機構の解析は、現代の分子細胞生物学の中核をなす研究分野の一つとなっている。それぞれの細胞が極性形成(すなわち、細胞内のいろいろな部品をある方向に向かって配置)しようとする時、必ず、それぞれの細胞は、基本となる座標軸を自らの中に有している筈である。このすべての細胞に普遍的な座標軸を、ここでは『細胞軸(Cellular Axis)』と呼ぶ。
 総括責任者らは、これまでタイトジャンクションと呼ばれる上皮細胞や内皮細胞の極性形成に決定的な役割を果たすと考えられてきた細胞間接着構造の解析を通して、細胞極性形成の分子機構の解明に寄与してきた。そして、タイトジャンクションで機能する接着分子、オクルディンとクローディンの同定に世界で初めて成功し、引き続いて、これらを出発点として、上皮細胞における極性形成のシグナルの流れを追い始めている。この流れを追い続けていくと、最終的には、極性形成に重要な細胞骨格である微小管系の構築や、細胞内膜系オルガネラの配置の分子機構の問題に行き着くことは明らかである。
 本プロジェクトは、我々が将来行き着くであろうこれらの問題に先回りして、細胞軸形成という観点からチャレンジを始めておくというものである。したがって、「ある問題を設定してそれを解く」といった形式のプロジェクトではなく、プロジェクト終了時にタイトジャンクションから進めてきた研究と合流して、次のより高いステップに進むための「種を探す」という形式のプロジェクトである。
 これまでの活動から、細胞軸決定に係わる可能性を持つものとして、また、今後の研究の「種」となる可能性を持つものとして、以下のものが同定され解析が始められた。先ず、<新規のタンパク質として>1)酵母のHSP70ファミリーに属する新規ストレスタンパク質、2)アンフォルジン、3)ツメガエルMAP4、4)ツメガエルPCM−1、5)線虫クローディンホモログ3種。<既知のタンパク質での新しい機能ドメインの発見>6)APCの微小管先端への濃縮に必要なドメイン、7)ショウジョウバエEカドヘリンのPCCDドメイン。<新しい複合体として>8)PCM−1を含み、中心体へ輸送される高分子密度の球状構造体、9)APCを含み微小管先端に輸送される複合体。さらに、ショウジョウバエ発生初期の、上皮細胞の形成・消失と細胞接着部位の変化についての新しい所見も得られた。

2.研究体制と参加研究者

○研究体制
蛋白輸送軸グループ  (京都府京都市下京区/京都リサーチパーク内)
【出芽酵母を用いてタンパク質分泌の軸を探る方向の研究】
細胞分裂軸グループ (京都府京都市下京区/京都リサーチパーク内)
【微小管細胞骨格の極性決定や細胞の不等分裂に重要であると思われている中心体の構造と機能を探る方向の研究】
形態形成軸グループ (京都府京都市下京区/京都リサーチパーク内)
【発生時の細胞軸の形成・消失の機構を上皮細胞の細胞軸形成に重要である細胞間接着という観点より探る方向の研究】
○参加研究者(グループリーダー、研究員)    (  )内は発足時からの通算
企業 大学・国研等 外国人 個人参加 総計
0(0) 0(0) 1(1) 8(8) 9(9)

3.研究成果の概要

○特許出願件数
国内 海外
○外部発表件数(論文・口頭発表)
国内 海外
論文
総説・書籍
口頭発表 16 24
17 15 32

【発表主要論文誌】
  J. Cell Biology/Developmental Biology/Mol. Biol. Cell/Dev. Gene & Evol./FEBS Lett.

主な研究成果

1) 蛋白輸送軸グループ
a) 酵母の場合、核の外膜に存在する主な未同定の成分のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列の特徴と、遺伝子破壊したものの表現型から、軸決定に関与する可能性のあるタンパク質を洗い出した。このHSP70に属するタンパク質は、小胞体・ゴルジ装置間の輸送、およびオルガネラのカルシウム維持に係わる酵素PMR1に高いホモロジーを持つことから、分泌タンパク質の細胞内輸送に係わることが示唆される。このタンパク質の遺伝子欠損株を作成したが、これは生育には異常がないが、出芽部位が変異していることから、細胞軸に異常が生じていると思われる。
b) 小胞体膜の塩抽出画分の種々の活性測定からは、新しくタンパク質高次構造を変換するシャペロンが見つかり、アンフォルジンと名付けた。これはアクチン結合部位を持つと思わる。
2) 細胞分裂軸グループ
a) ツメガエルの中心体を単離し、それを抗原として抗体を多数取り、その抗原が中心体に局在するものを調べた。そのうちPCM−1についてcDNAをクローニングし、GFPをタグとしてその動態を調べた結果、これは中心体にずっと存在するのでなく、高分子密度の球状構造体に局在し、これが微小管のレール上を動いて中心体に集積することが分かった。また、この運動にはモータータンパク質ダイニンが関与することが分かった。
 中心体タンパク質を認識する抗体は、他に十数種類得られており、クローニングされたものの細胞内局在についての実験が、現在進行中である。
b) ガン抑制遺伝子であるAPCをGFP融合タンパク質としてカエルの培養細胞であるA6細胞に発現させ、APCが細胞の突起部の微小管の先端に特異的に濃縮する様子を生細胞で経時的に観察した。さらに、APCの部位欠失変異体を数種類作成し、微小管先端に濃縮するために必要な部位を同定した。さらにAPC発現株の電顕観察により、微小管先端に濃縮したAPC複合体の形態をとらえることができた。また、APCに結合することが知られているEB-1をGFP融合タンパク質としてA6細胞に発現したところ、APCと非常によく似た挙動を示すことがわかった。
c) ツメガエルの微小管結合タンパク質p220の分子クローニングを行い、これがMAP4のホモログ(XMAP4)であることを明らかにした。cdcキナーゼによりリン酸化型を受けない変異XMAP4を発現したA6細胞では、分裂後期における染色体の中心体方向への移動が起きず、このリン酸化が分裂後期の染色体分配に必要であると考えられる。
d) 細胞軸の決定に関与する可能性がある哺乳動物のタイトジャンクションの構成タンパク質クローディンの線虫ホモログ3種を見いだした。GFPラベルしたこれらのタンパク質は線虫のpharynxや精巣に発現する事が分かった。dsRNAを用いた抑制実験の結果は、これら3種のタンパク質の発現の抑制は、精子の数で決まる生まれる子供の数の大幅な減少を引き起こすことが分かった。
3) 形態形成軸グループ
a) DEカドヘリンやDαカテニンのような細胞接着部位に局在するタンパク質をGFPと融合させ、これを胚初期から発現するトランスジェニックフライを作り、ショウジョウバエ胚の表層外胚葉の原腸陥入時や気管組織(トラケア)の形態形成における細胞の運動を観察した。アドヘレンスジャンクションは固定的なものではなく、ダイナミックにその構造を変えていることが明らかになった。さらに、カドヘリン、カテニンの突然変異体をレスキューする解析によって、形態形成に重要な分子ドメインが明らかになった。また、カドヘリン-カテニンの複合体は単に細胞間の接着だけでなく細胞の極性の制御にも深くかかわっていることが示唆された。
 脊索動物を除く後生動物のカドヘリンに保存されたドメイン (primitive classic cadherin domain, PCCD)は、カドヘリンが細胞膜に正常に移行するために必要であることが示唆された。
b) 卵細胞の形成時に、卵細胞に向かって移動するボーダー細胞にカドヘリンのGFP融合分子を発現させると、その分子が後方に放出されることも明らかになった。また、電子顕微鏡による観察では、ボーダー細胞は周りの細胞が出す絨毛様突起に覆われて移動していることがわかった。さらに、アクチンのGFP融合分子を用いた生きている卵巣の観察では、細胞前部のフィロポディアでアクチン繊維がダイナミックに挙動しているのを見ることができた。
c) γチューブリンは中心体に局在することから細胞極性形成に働きうる候補遺伝子で、この遺伝子を欠失させたマウスES細胞を得ることに成功し、現在欠失個体の作製を試みている。欠失ES細胞及びマウス胚の上皮細胞を解析することによって、γチューブリンが上皮極性の構築及び維持に果たす役割が明らかになると考えている。


This page updated on May 12, 2000
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